kan tages nogle grundlæggende trin til at fremskynde den samlede TOPO kloning proces og hjælpe med at sikre dens succes. For det første bør rør af levedygtige celler anbringes på is for at bevare deres acceptabilitet . Dernæst skal den super optimale kultur ( S ) medium bakterievækst beriget med næringsstoffer , bringes til stuetemperatur. De selektive plader skal derefter forvarmes til 37 grader Celsius , så de er helt klar , når det drejer sig tid til at bruge dem .
Kombinere ingredienser
Til at begynde kloningen proces , bør en kombination af 2 mikroliter af polymerasekædereaktion ( PCR) produkt , 0,5 mikroliter saltopløsning , og 0,5 mikroliter kloningsvektor kombineres i en 0,5 - ml centrifugerør. Når kombineret, vil disse bestanddele skal indstilles ved stuetemperatur og fik lov at inkubere i fem til ti minutter. Dernæst vil de kombinerede ingredienser tilsættes til "top- 10 kemisk kompetente celler " i en 50 mikroliter reagensglas og anbringes på is i yderligere ti minutter. Efter dette , skal cellerne varmechok ved 42 grader Celsius nøjagtigt og anbragt på is i yderligere et minut , før der tilsættes 180 mikroliter af SOC-medium . Denne blanding bør derefter rystet i en horisontal retning ved 200 rpm i yderligere en time ved 37 grader Celsius.
Endelige skridt
En blanding af 50 mikroliter og 100 mikroliter af hver reaktion skal udpladet " på LB + AMP + X -gal -plader og inkuberes uden omrystning natten over ved 37 ° C " Den næste dag tre hvide kolonier fra hver reaktion skal plukkes ud og anbringes i 4 ml LB + AMP og efterladt til inkubering natten over ved en temperatur på 37 grader Celsius under omrystning ved 200 omdrejninger pr . Det sidste trin er mini- forberedelse af plasmider og venter på at se, om processen var vellykket .
Clipart